氯过氧化物酶对苯酚生物降解的促进作用及其动力学研究

【摘要】苯酚是现代化学工业中常用的生产原料，全球年产量超过180万吨以上。与此同时，因为苯酚的生产和消费每年又会向环境中排放大量的含酚废水。由于苯酚具有活泼的化学性质和稳定的苯环结构，苯酚污染物已经成为环境中残留的难降解、有毒和有害污染物质的代表。好氧生物氧化是苯酚降解的重要途径，其中的苯酚羟化酶（PHO）、邻苯二酚1，2-加氧酶（CatA）和邻苯二酚2，3-加氧酶(CatO2ase)等氧化还原酶是苯酚氧化的限速酶。由于加氧酶多为诱导酶，生物合成对诱导物存在依赖性和滞后性，而且经过不同加氧酶途径氧化苯酚的可生化性速率也有差异，会延长苯酚的毒性，影响苯酚的去除效率。本文采用共代谢原理驯化筛选具备PHO、CatO2ase或CatA加氧酶系的苯酚降解菌株，并与制备的固定化氯过氧化物酶（CPO）协同氧化苯酚，建立高效率的酶-菌苯酚复合降解体系，促进苯酚污染物的生物氧化和可生化去除，改进传统的苯酚生物降解方式。论文研究取得了以下结果：1、利用了邻苯二酚与2-羟基-粘糠酸半醛（HMS）和粘糠酸(MA)作为苯酚降解的共代谢基质，分别诱导含CatO2ase或CatA加氧酶途径的微生物增殖，并从中分离筛选出不同加氧酶类别的高活性苯酚降解菌株L2和L6。菌株经过常规方法和分子生物学方法鉴定L2为Delftiasp.，具备CatA加氧酶，而L6为Sphingomonassp.，具有CatO2ase加氧酶；同时，研究还发现外加邻苯二酚虽然能加快诱导加氧酶的合成，但同时会抑制PHO的合成，反而降低了苯酚氧化成邻苯二酚的速度。2、利用亲水性高分子聚合物PEG在高饱和度(NH4)2SO4溶液中夹带沉淀海洋真菌Caldariomycesfumago发酵液中微量的CPO，再通过磷酸盐溶液复溶形成双水相萃取，可以低成本、高回收率地提取高纯度CPO。CPO用海藻酸钠与卡拉胶复合载体固定后应用于苯酚氧化。在40℃,pH6.5,H2O210mg/L的条件下10g/100mL固定化CPO对500mg/L和1000mg/L苯酚2h时的转化速率分别达到86.57%和83.83%,能快速钝化苯酚的化学活性,增加苯酚氧化生成邻苯二酚的速度,加快加氧酶诱导合成速度。3、运用响应面分析实验设计方法优化了固定化CPO与不同加氧酶类别的L2和L6菌株的复合比例以及降解条件,结果显示实验条件下以10g/100mL固定化CPO与L2与L6菌株标准菌悬液(OD600=1.0)按1：1(v/v)接种量0.75%(v/v)的混合降解体系,在初始pH7.1、苯酚浓度500mg/L、酵母膏加量200mg/L、FeSO42.5mg/L邻苯二酚加量200mg/L和装液量75mL/250mL时16h苯酚转化率达到97.87%,比优化前的91.78%增加了6.1%,苯酚彻底降解提前了4h以上,CODCr彻底去除提前了8h以上。此外,外加1%的蔗糖、葡萄糖或半乳糖等辅助碳源还能进一步提高酶-菌复合体系的苯酚降解作用。4、实验验证了CPO转化苯酚形成的中间产物邻苯二酚有助于形成菌体降解苯酚的共基质效应,并能提高酶-菌复合体系降解对苯酚的适应浓度。动力学模型拟合表明,在100-1200mg/L苯酚浓度范围内实验得出：(1)单一以固定化CPO转化苯酚的Haldane方程为：R%0.9646：(2)单纯以复合菌株降解苯酚的Haldane方程为：R2=0.954；(3)固定化CPO与复合菌株组成的酶-菌复合体系降解苯酚的Haldane方程为：3组方程与实验结果的拟合度均较高,其中,酶-菌复合体系具有的最大比降解速率最高(qmax=1.95×10-4h-),基质饱和常数较低(ks=1.0501mg/L),基质抑制常数最高(KI=5.1272mg/L),说明了酶-菌复合降解体系的反应速度快,对苯酚的亲和力高,对高浓度苯酚的抗抑制能力强,参数表征了实验所建立的酶与菌株复合生物降解体系具有明显的降酚优势,为苯酚的生物降解提供了一种新的模式。
【作者】陈军；
【导师】张永明；
【作者基本信息】上海师范大学，环境科学，2014，博士
【关键词】苯酚降解；氯过氧化物酶；苯酚羟化酶；邻苯二酚1,2-双加氧酶；邻苯二酚2,3-双加氧酶；酶菌复合体系；降解动力学；

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